ISSN 1866-8836
Клеточная терапия и трансплантация

Функциональные различия в составе Т-лимфоцитов трансплантатов: экспериментальные данные

Михаил Ю. Дроков, Елена Н. Паровичникова, Дарья С. Дубняк, Лариса А. Кузьмина, Ирина В. Гальцева, Юлия О. Давыдова, Николай М. Капранов, Вера А. Васильева, Ольга М. Королева, Екатерина Д. Михальцова, Наталья Н. Попова, Татьяна В. Гапонова, Валентина Н. Двирнык, Ольга Н. Байтерякова, Григорий А. Ефимов, Александр А. Вдовин, Валерий Г. Савченко
Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр, Москва, Россия
doi 10.18620/ctt-1866-8836-2016-5-3-26-29
Отправлено 01 Августа 2016
Одобрено 20 Сентября 2016

Резюме

Введение

Хорошо известен факт, что при использовании в качестве трансплантата мобилизованных стволовых клеток крови (СКК) время восстановления количества нейтрофилов значимо меньше, чем при использовании костного мозга (КМ). В то же время частота развития острой реакции трансплантат против хозяина (оРТПХ) значимо ниже при использовании КМ, чем при СКК. Почти все авторы объясняют эти факты различным количеством Т-лимфоцитов (CD3+) в трансплантате, акцентирую свое внимание на эффекторной субпопуляции Т-клеток (CD3+CD8+). Однако практически нет данных о функциональных различиях в составе другой не менее важной популяции клеток, а именно субпопуляции Т-хелперов (CD3+CD4+), которые ответственны за регуляцию практически всех процессов в Т-клеточном звене иммунной системы. Функциональные свойства Т хелперов - принадлежность к той или иной функционально активной популяции могут быть определены по виду цитокина, который он секретирует при стимуляции его Т-клеточного рецептора (ТКР). Для неспецифической стимуляции ТКР используются суперантигены (сАГ). Использование сАГ вызывает независимую от Vβ-домена ТКР, стимуляцию, а также приводят к формированию функционально активных связей между ТКР и главным комплексом гистосовместимости (ГКС) антиген-презентирующих клеток (АПК). Таким образом, под действием сАГ в течение нескольких часов Т-лимфоциты начинают секретировать цитокины, по которым клетку можно отнести к той или иной функционально активной субпопуляции хелперов. Далее нами представлены данные по исследованию функционального состава Т-хелперов трансплантатов, полученных от здоровых доноров.

Пациенты и методы

В исследование были включены 9 образцов трансплантатов, полученных от здоровых доноров (КМ: n=3, СКК: n=6). СКК были получены путем афереза у донора после стимуляции его гемопоэза в течение 5 дней Г-КСФ в дозе 10 мкг/кг. Один миллион клеток полученный из трансплантата в среде RPMI-1640 (в присутствии 10% аутологичной сыворотки) инкубировали с сАГ в рекомендованной концентрации. В качестве сАГ для стимуляции Т- клеток использовали Cytostim (Miltenyi Biotec, Германия). Спустя 2 часа после начала стимуляции с целью выполнения в дальнейшем внутриклеточного окрашивания добавляли блокатор белкового транспорта - брефелдин A. После этого клетки продолжали инкубировать еще в течение 4 часов при 37°C, CO2 - 5%. В дальнейшем было выполнено внутриклеточное окрашивание согласно стандартному протоколу (Cytofix/ Cytoperm, BD, USA). Для идентификации Т-хелперов использовали моноклональные антитела к антигенам CD45-APC , CD4-APC-Cy7, FoxP3-PerCP-Cy5.5, IL-17APE фирмы BD и CD294-FITC фирмы Biolegend, антиINF-γ-PE-Cy7 (см рисунок 1) (Th1:CD45+CD4+INF-γ+; Th2:CD45+CD4+CD294+ ;Treg:CD45+CD4+FoxP3+; Th17:CD45+CD4+IL-17A+). 30000 CD4+ клеток анализировали на проточном цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, USA).

Результаты и обсуждение

Как представлено на рисунке 2 (слева) все образцы костного мозга имеют равное соотношение Th1:Th2:Treg:Th17 клеток, которое не отличается от того, что наблюдается в периферической крови (ПК) здоровых доноров. Вероятно, это связано с тем, что все Т-лимфоциты КМ являются лимфоцитами ПК, попавшими в трансплантат во время эксфузии костного мозга. С другой стороны, в СКК (рисунок 2, справа), все образцы трансплантатов имеют различное соотношение Th1:Th2:Treg:Th17 клеток. Учитывая широкое распространение, которое получило абсолютное количество CD34+ клеток при характеристике трансплантатов в клинической практике, а также исходно различное число ядросодержащих клеток в каждом из трансплантатов, мы рассчитали какое число Th1, Th2, Treg, Th17 клеток приходится на 100 CD34+ клеток (нормализовали на число CD34+ клеток) в КМ (рисунок 3, слева) и СКК (рисунок 3, справа). Как видно из рисунка 3 (справа), соотношение Th1, Th2, Treg, Th17 к CD34+ клеткам в СКК может варьировать (отличаться до 40 раз!) от образца к образцу.

Заключение

Таким образом, стимуляция Т-лимфоцитов трансплантата сАГ in vitro может отражать те процессы, которые происходят с Т-клетками in vivo после трансфузии, и может быть использована как модель для изучения влияния функционального состава трансплантата на развитие оРТПХ, отторжения и других процессов, в которых Т-клетки трансплантата принимают непосредственное участие. Наши предварительные данные показывают, что функциональный состав Т-лимфоцитов трансплантата очень вариабелен от образца к образцу и может влиять на процессы, которые происходят в иммунной системе реципиента после трансфузии трансплантата.

Ключевые слова

т-регуляторные клетки, стволовые клетки крови, трансплантат, т хелперы, тh17, th1, th2, костный мозг, острая ртпх


Том 5, Номер 3
30.09.2016 12:09:00

Загрузить версию в PDF

doi 10.18620/ctt-1866-8836-2016-5-3-26-29
Отправлено 01 Августа 2016
Одобрено 20 Сентября 2016

Возврат к списку