ISSN 1866-8836
Клеточная терапия и трансплантация

Возможности и перспективы использования конфокальной микроскопии для оценки результатов перекрестного типирования HLA у пациентов с трансплантацией костного мозга

Альберт Р. Муслимов, Александр С. Тимин, Юрий А. Серов
Институт детской гематологии, онкологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова

Загрузить версию в PDF

Клеточная терапия и трансплантация (КТТ)
Том 7, номер 3
Contents 

Резюме

Введение

В последние годы становится все более очевидным, что роль анти-донорских HLA антител, направленных против антигенов HLA класса I и II не ограничивается их участием в развитии сверхострого отторжения аллотрансплантатов. Все большее число исследователей склонны считать, что образование анти-донорских HLA антител в посттрансплантационный период приводит к развитию ускоренного острого, острого или хронического отторжения. Тест на иммунологическую совместимость между донором и реципиентом при трансплантации является решающим показателем для принятия решения о проведении трансплантации. Антитела к HLA обнаруживаются более чем у 30% населения, их выявление свидетельствует о предшествующей иммунизации HLA. Она возможна при многократном переливании цельной крови, во время беременности и после трансплантации. Ряд авторов отмечает, что донор неспецифические антитела к HLA являются одним из факторов не только риска острого, но и хронического отторжения трансплантата и учитываются, как плохой прогностический показатель [P.I.Terasaki, 2006; М. Моrrel, 2011; M. Crespo, 2011].

Цель

Целью теста HLA-Crossmatch является обнаружение лимфоцитотоксических антител, специфичных для потенциального донора (то есть аллогенный перекрестный кроссматч) или у самого себя (то есть аутологичный перекрестный HLA-Crossmatch). Прямой HLA-Crossmatch, используется с сывороткой от предполагаемого реципиента (или донора для обратного HLA-Crossmatch) и клетками-мишенями являются мононуклеарные клетки потенциального донора (или реципиента для обратного HLA-Crossmatch. Используемые клетки-мишени могут быть не разделены или разделены на определенные группы, такие как Т- лимфоциты, В- лимфоциты, моноциты и т. д. Оценка результатов реакции HLA-Crossmatch крайне субъективна при простой оптической микроскопии, т.к. невозможно точно посчитать количество мертвых клеток в поле зрения камеры Терасаки и вычесть фон (результаты негативного контроля). Невозможна так же оценка к какому классу HLA (I или II) принадлежат антитела.

Материалы и методы

Нами был разработан метод оценки результатов HLACrossmatch с использованием конфокального микроскопа у пациентов с трансплантацией костного мозга. Вся постановка реакции HLA-Crossmatch проводилась стандартным методом, кроме последнего этапа: окраски и оценки жизнеспособности лимфоцитов в лунках. Мы использовали Акридиновый Оранжевый (АО – эмиссия 525 нм) и Пропидиум Йодид (PI – 620 нм) как витальные красители. Для окраски B лимфоцитов использовались анти-CD19 моноклональные антитела, конъюгированные с PE-Cyanine7 (775 нм). Результаты регистрировались с помощью ZEISS конфокального микроскопа с последующим анализом изображений программным продуктом ImageJ (National Institutes of Health) c последующим обсчетом результатов нами созданной программой.

Выводы

Предложенный нами метод оценки имеет следующие преимущества: 1) В одной лунке производится анализ одной сыворотки реципиента на наличие антител против донорских антигенов HLA одновременно и по I, и по II классу; 2) Метод является быстрым, точным и высокопроизводительным (в одной камере Терасаки за один запуск можно проанализировать до 72 сывороток); 3) Высокая чувствительность считывания флуоресцентной метки; 4) Наличие многоуровневой системы различных контролей; 5) Возможность архивирования полученных результатов в базе данных программы для интерпретации и PDF отчетов; 6) Субъективная оценка в анализе результатов сведена к минимуму за счет статистической обработки полученных данных программным обеспечением.

Ключевые слова

HLA, перекрестный подбор HLA, трансплантация костного мозга, конфокальная микроскопия.


Возврат к списку