AW-01. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток человека с нокаутом гена CCR5 нуклеазой CCR5-Uco-TALEN мышам линии NBSGW: пилотное исследование
Ярослава В. Комарова1, Алена И. Шакирова1, Владислав С. Сергеев1, Светлана А. Осипова2, Екатерина В. Щелина2, Анатолия В. Онопченко2, Марина Л. Васютина2, Ольга Г. Бреднева2, Кирилл С. Яковлев3, Яна Р. Оршанская3, Константин В. Сивак3, Тимофей Е. Карпов1, Альберт Р. Муслимов1, Марина О. Попова1, Кирилл В. Лепик1, Александр Д. Кулагин1
1 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 Национальный медицинский исследовательский центр им. В. А. Алмазова, Санкт-Петербург, Россия
3 НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева, Санкт-Петербург, Россия
Резюме
Методика трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) иммунодефицитным мышам является ключевым компонентом в доклинических испытаниях биологически модифицированных медицинских клеточных продуктов. Традиционной in vivo моделью, используемой для исследования человеческого гемопоэза, является линия мышей NSG (NOD scid gamma), однако в последние годы все более популярна новая линия NBSGW [Adigbli et al., 2021]. В отличие от NSG, мыши NBSGW не нуждаются в предтрансплантационном кондиционировании благодаря наличию мутации c-Kit – рецептора фактора стволовых клеток, обеспечивающей преимущество трансплантированных клеток. В рамках настоящего исследования, впервые в России, мыши этой линии были использованы для исследования способности к мультилинейному восстановлению кроветворения и биораспределения модифицированных ГСК человека после in vitro редактирования гена CCR5 с помощью сайт-специфической нуклеазы TALEN.
Цель
Оценить способность к мультилинейному восстановлению кроветворения и исходы трансплантации ГСК человека с нокаутом гена CCR5 in vivo. Материалы и методы Производство прототипов клеточного продукта CD34+ ГСК с нокаутом гена CCR5 было осуществлено в соответствии с описанным ранее протоколом [Shakirova et al. Mol. Ther. 2022 30;4S1]; образцы прототипов криоконсервированы. Процедура трансплантации, наблюдение за животными и отбор биоматериала проводился в условиях вивария барьерного типа на базе ЦДТИ «НМИЦ им. В. А. Алмазова». В исследование было включено шесть мышей (самки) линии NBSGW, полученные из Jackson Laboratory (США), медиана возраста составила 9 (8-10) недель. Кондиционирование не проводилось. На день 0 трем мышам была произведена трансплантация СD34+ клеток в дозе 1×106, двум – в дозе 2×106, одной особи трансплантация не проводилась (контроль). Животные содержались в условиях барьерного SPF вивария, под ежедневным наблюдением, ветеринарный осмотр и контроль веса – еженедельно. На день 56 мыши были выведены из эксперимента: образцы крови, костного мозга (КМ) и клеток селезёнки, использовались для проведения иммунофенотипирования (ИФТ) (7AAD, CD45 человеческий) и последующего выделения ДНК с целью оценки донорского химеризма и доли аллелей с нокаутом гена СCR5 методом ddPCR [Mock et al., 2015]. Проведено гистологическое исследование образцов тканей КМ, селезенки, сердца, печени, почек, кишечника, мышц и кожи.
Результаты
За время наблюдения случаев гибели животных зарегистрировано не было, как и признаков неблагополучия. Зафиксирована еженедельная прибавка в весе в пределах видовой нормы, признаки РТПХ отсутствовали. В результате ИФТ образцов значимый уровень химеризма выявлен в КМ – 3,8%-38,7% с максимальными значениями у особей, получивших более высокую дозу ГСК. В крови и селезенке уровень химеризма достигал 0,2%-3,8% и 0,5%-1,0% соответственно. Частота нокаута гена СCR5 в клетках селезенки составила 18,6% (13,4%-21,9%), в КМ f 19,8% (5,6%-30,1%), в образцах ДНК крови аллелей с нокаутом не выявлено. Гистоархитектоника образцов кожи и скелетных мышц, миокарда, кишки, печени, почек соответствовала видовой норме. В представленных образцах селезенки всех животных выявлена аплазия белой пульпы и выраженный экстрамедуллярный гемопоэз – трехлинейная миелопролиферация, без значимых различий. При исследовании костного мозга контрольного животного – нормальное строение костного мозга. У особей экспериментальной группы – очаги кроветворения, образованные не видотипичными средне- и крупноразмерными клетками. При гистологическом исследовании образцов тканей и органов признаков неоплазии не выявлено.
Выводы
В данном пилотном исследовании отработана методика трансплантации человеческих ГСК мышам линии NBSGW. При отстутствии предтрансплантационного кондиционирования зафиксированы признаки приживления ГСК человека. Подтверждено сохранение способности к мультилинейному восстановлению кроветворения и биораспределению ГСК после процедуры редактирования гена CCR5.
Авторы благодарят за финансовую поддержку Российский Фонд Фундаментальных Исследований, грант №19-29-04025мк.
Ключевые слова
Трансплантация, гемопоэтические стволовые клетки, редактирование генома, TALEN, CCR5, модель, мыши NBSGW, мыши NSG.
