GC-09. Тестирование малых молекул для стимуляции процесса гомологичной репарации концов двуцепочечных разрывов ДНК в локусе CCR5 при трансфекции гемопоэтических стволовых клеток человека мРНК CCR5-Uco-TALEN
Алена И. Шакирова1, Кирилл В. Лепик1, Альберт Р. Муслимов1, Владислав С. Сергеев1, Т. Р. Карпов1, К. И. Аношкин2, Марина О. Попова1, Борис Фезе1,3, Александр Д. Кулагин1
1 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский
государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 Медико-генетический научный Центр им. Н. П. Бочкова, Москва, Россия
3 Отдел клеточной и генной терапии, Департамент трансплантации стволовых клеток, Университетский медицинский центр Гамбург-Эппендорф, Гамбург, Германия
Резюме
Таргетные инсерции в геном гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) участков белок-кодирующих последовательностей с последующей аутологичной трансплантацией таких клеток является показанием для генной терапии целого ряда моногенных заболеваний человека. Беспрецендентной точностью в этом плане обладает генная терапия с использованием современных инструментов редактирования генома (RNA-guided инженерные нуклеазы, TALEN, ZFN). При их применении процесс протекает за счет так называемого гомологичной репарации (ГР) концов двуцепочечного разрыва (ДР) ДНК, образуемого нуклеазой. Повышение эффективности ГР является актуальной задачей, решение которой позволит с большей эффективностью производить вставки крупных участков ДНК в геном ГСК при доставке донорской репарационной матрицы как вирусными, так и невирусными носителями. Механизмы врожденного иммунного ответа, вызванного повреждением ДНК, представляют собой важный фактор, влияющий на результаты образования ДР, индуцированных инженерными нуклеазами. Целью данной работы является оценка влияния добавления низкомолекулярных ингибиторов TLR9/AIM2/cGAS, STING и антагонистов каспаз A151, H151 и Z-VAD-FMK к культурам первичных ГСК человека на частоту ГР в локусе CCR5 после трансфекции мРНК CCR5-Uco-TALEN.
Материалы и методы
Синтез предварительно кодон-опимизированной посредством деплеции уридина мРНК CCR5-Uco-TALEN был осуществлен компанией Trilink (США). Магнитную селекцию CD34+ ГСК из костного мозга здоровых доноров проводили с помощью набора CD34 MicroBead kit (Miltenyi Biotec). Далее, после активирующей фазы культивирования, осуществляли трансфекцию ГСК мРНК CCR5-Uco-TALEN на приборе Gene Pulser Xcell (BioRad). После трансфекции ГСК в течение суток культивировали при 32°С в среде StemMACS HSC Expansion Media XF (Miltenyi Biotech). Низкомолекулярные ингибиторы A151, H151 и FMK добавляли в концентрациях 4 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, и 25 мкг/мл соответственно за 3 часа до электропорации. Долю событий негомологичного (НГР) сшивания концов разрыва в локусе CCR5 оценивали методом цифровой капельной ПЦР по описанному ранее протоколу (Mock et al., 2015) на приборе Bio-Rad QX200. Для оценки аллельной нагрузки репарированных на основе гомологии разрывов дополнительно методом мультиплексной цифровой капельной ПЦР оценивали количество копий референсного гена EPOR и копий гена CCR5 дикого типа (Schwarze et al., 2021). Разницу между количеством копий референсного гена и суммой аллелей НГР и дикого типа считали долей аллелей, репарированных ГР.
Результаты
Согласно полученным результатам суммарная средняя эффективность нокаута гена CCR5, рассчитанная как сумма репарированных НГР и ГР аллелей, составляла от 9 до 53,5%. Добавление в культуру ГСК малой молекулы FMK значительно отразилось на общей эффективности нокаута гена CCR5, которая в этом образце была максимальной и составляла 53,5%, причем увеличилась частота как НГР (27,2%), так и ГР (26,3%) событий по сравнению с контролем. Добавление Н151 на общей эффективности нокаута гена CCR5 не отразилось (33,5%), причем это касалось также соотношения НГР (18,3%) и ГР (15,2%) аллелей в образцах. В образцах ДНК, выделенной из клеток, культивируемых в присутствии A151, эффективность нокаута гена CCR5 была значительно снижена и составила 9%, причем 95,6% нокаутированных аллелей были результатом НГР в локусах разрывов, формируемых CCR5-Uco-TALEN.
Заключение
Выполнено тестирование эффективности добавления малых молекул в плане стимуляции ГР в первичных гемопоэтических стволовых клетках человека при трансфекции мРНК CCR5-Uco-TALEN. FMK представляется наиболее перспективной из них в плане разработки генной терапии на основе комбинации донорской матрицы и инструментов редактирования генома.
Благодарности
Лепик К.В. благодарит за поддержку Российский фонд фундаментальных исследований, грант No. 19-29-04025mk.
Ключевые слова
TALEN, гомологичная репарация, ингибиторы STING, гемопоэтические стволовые клетки.
