ISSN 1866-8836
Клеточная терапия и трансплантация

Мезенхимные стволовые клетки: захват, токсичность и влияние на функциональные свойства многослойных полиэлектролитных микрокапсул

К. В. Лепик1, В. С. Сергеев1, А. Р. Муслимов1, Д. С. Романюк1, Р. Т. Михелашвили1, И. С. Моисеев1, Е. В. Попова2,И. Л. Радченко2, А. Д. Вилесов1, Г. Б. Сухоруков2, 3, Б. В. Афанасьев1

1 Институт детской гематологии, онкологии и трансплантологии имени Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Россия

2 Санкт-Петербургский Политехнический Университет имени Петра Великого, Россия

3 Лондонский университет королевы Марии, Великобритания

Загрузить версию в PDF

Клеточная терапия и трансплантация (КТТ)
Том 5, Номер 1
Contents 

Резюме

Введение

Многослойные полиэлектролитные микрокапсулы привлекают все больший интерес как перспективное средство доставки лекарственных веществ, диагностический и исследовательский инструмент. Основными преимуществами подобных микрокапсул является контролируемый размер и форма, толщина и структура оболочек, позволяющих осуществлять контролируемую доставку содержимого посредством магнитного поля, светового излучения или ультразвуковых волн, а также легкость функционализации поверхности капсулы. В настоящий момент, мезенхимные стволовые клетки (МСК), являются одной из наиболее популярных клеточных популяций в широком диапазоне клинических и научных исследований. Однако, данные об эффективности захвата капсул, а также их влиянии на функциональные свойства клеток данного типа в настоящий момент отсутствуют.

Материалы и методы

Получение МСК из костного мозга здоровых доноров и их экспансия осуществлялась согласно стандартному протоколу. Для экспериментов использовались клетки второго и третьего пассажа. В исследование включено две основных ветви в зависимости от состояния клеток, к которым добавлялась суспензия 5 мкм PAH /PSS магнитных полиэлектролитных микрокапсул, меченых FITC. В первой суспензия микрокапсул добавлялась к адгезированным на поверхности культурального пластика клеткам в соотношении 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 . Во второй смешивались суспензии микрокапсул и МСК в тех же соотношениях. После 24 часов инкубирования, эффективность захвата оценивалась при помощи конфокальной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Морфология клеток и жизнеспособность оценивалась с использованием гемоцитометра и витальных красителей трипанового синего/пропидия йодида. Способность к дифференцировке была исследована с использованием стандартных протоколов цитодифференцировки МСК в остеогенном и адипогенном направлении. Магнитная сепарация клеток, ассоциированных с магнитными микрокапсулами производилась с использованием системы midiMACS. Адгезионные свойства МСК оценивались следующим образом: МСК ассоциированные с капсулами в соотношениях 1:5 1:10 1:20 рассевались на культуральные флаконы в концентрации 20×104/cм2 при стандартных условиях. После 24 часов инкубирования кондиционная среда удалялась, адгезированные клетки удалялись путем трипсинизации. Суспензионная и адгезионная фракции подсчитывались с использованием гемоцитометра.

Результаты

Эффективность ассоциации клеток и микрокапсул коррелируют с числом добавленных капсул и используемым методом. Средний процент клеток ассоциированных с микрокапсулами при их добавлении в адгезионную культуру 8% (при соотношении клетки/капсулы 1:1) 18% (1:3) 32% (1:10); при добавлении к МСК в суспензионной форме 90% (1:1) 98% (1:3) 99% (1:10). Одиночные клетки показывают способность к захвату до 30 микрокапсул. Меньшая часть капсул ассоциирована с клеточной мембраной, но не интернируется клеткой. После интернализации микрокапсулы диспергируются в цитоплазме, главным образом в перинуклеарном компартменте клетки. Средний процент жизнеспособных клеток после инкубации с микрокапсулами в течении 24 часов, нормализованный относительно клеток контрольной группы составили 90% (при соотношении клетки/капсулы 1:5), 85% (1:10), 83% (1:20), 5% (1:100).Клетки ассоциированные с магнитными микрокапсулами могут быть с высокой эффективностью изолированы при помощи рутинных методов магнитной сепарации. Способность МСК остеогенной и адпиогенной дифференцировке значимо не изменилась с захватом микрокапсул. Анализ адгезионной активности продемонстрировал что адгезионная фракция значимо уменьшалась с увеличением соотношения клеток и микрокапсул. Средний процент адгезионных клеток составил 85% в группе (1:5), 64% (1:10), 38% (1:20) по сравнению с 85% в контрольной группе.

Выводы

Полиэлектролитные микрокапсулы могут быть захвачены МСК с высокой эффективностью. Оптимальные условия для захвата микрокапсул – клеточная суспензия. Полиэлектролитные капсулы демонтрируют незначительную цитотоксичность и влияние на клеточные функции при умеренном соотношении клетки:микрокапсулы (<1:10). Критическое снижение жизнеспособности клеток наблюдалось только к группе крайне высокого (1:100+) соотношения. Способность МСК остеогенной и адипогенной дифференцировке значимо не изменилась с захватом микрокапсул. Адгезионная способность МСК снижалась в зависимости от дозы добавленных микрокапсул. Захват большого числа микрокапсул снижает адгезионные способности МСК. Полиэлектролитные микрокапсулы – перспективный инструмент доставки клеток и лекарственных средств, с возможностью внешнего контроля посредством магнитного поля.

Ключевые слова

адгезия, дифференцировка, микрокапсулы полиэлектролитные, интернализация, мезенхимные стволовые клетки


Возврат к списку