Прогностическая значимость уровней цитокинов для острой реакции «трансплантат против хозяина» при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с посттрансплантационным применением циклофосфамида

Резюме

Введение

Острая реакция «трансплантат против хозяина» (оРТ-ПХ) acute graft-versus-host-disease остается одним из наиболее серьезных осложнений аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Секреция больших количеств цитокинов вызывает активацию аллореактивных Т-клеток в ранние сроки после ТГСК является важным этапом в патогенезе оРТ-ПХ. Основные иммунологические события, ведущие к оРТПХ развиваются в течение нескольких недель после пересадки. По этой причине изучение профиля цитокинов могло бы применяться для прогнозирования РТПХ. Большинство исследований цитокинов при алло-ТГСК проводилось с классической профилактикой этого состояния, состоящей из неспецифических иммуносупрессивных агенто, в частности, ингибиторов кальцинейрина, метотрексата, микофенолята мофетила, антитимоцитарного глобулина и др. При использовании этого типа профилактики, многие исследования согласны в том, что повышенные уровни провоспалительных цитокинов связаны с развитием острой РТПХ, тогда как более низкие уровни указывают на эффективную иммуносупрессию, предотвращающую аллореактивный ответ. С недавних пор многие трансплантационные центры интересуются новым подходом профилактики РТПХ, основанным на введении циклофосфамида после ТГСК (ПТЦф). В настоящее время нет ясности относительно того, сходны ли здесь изменения цитокинового фона с тем, что наблюдается при классической профилактике РТПХ. Неясно также, остаются ли валидными известные прогностические маркеры после терапии ПТЦф. В попытке ответить на эти вопросы мы провели пилотное исследование цитокинов плазмы крови, чтобы определить их динамику у пациентов после ТГСК с применением ПТЦф для профилактики РТПХ. Для этого исследования мы выбрали пять цитокинов: IL-17, IL-6, IL-8, IFN-γ и TNF-α, которые, по ряду работ, имеют прогностическое значение при острой РТПХ. Поэтому мы сравнивали их уровни у пациентов, у которых развилась оРТПХ по сравнению со случаями без РТПХ.

Пациенты и методы

Среди 192 больных, трансплантированных с профилактикой РТПХ с помощью ПТЦф в Первом Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. И.П.Павлова в 2014-2015 гг., мы выявили 20 случаев оРТПХ, у которых исследовали образцы плазмы крови. Эти больные были сопоставимы с пациентами, у которых не развилась острая РТПХ, в соотношении 1:2. В порядке снижения приоритетности, критерии подбора были следующими: тип донора, источник трансплантата, интенсивность кондиционирующего режима, первичный диагноз и статус заболевания. Таким образом, общая группа состояла из 60 взрослых пациентов с онкогематологическими заболеваниями после ТГСК. Все пациенты подписывали информированное согласие на забор образцов крови и использование их персональных данных для научных целей. 28% больных получили трансплантаты от родственного донора, 72% от неродственных доноров. Больные получали либо миелоаблативный режим кондиционирования (МАК) с пероральным приемом бусульфана (16 мг/кг) и циклофосфамидом (100 мг/кг), либо кондиционирование сниженной интенсивности (RIC) с применением бусульфана перорально (8 мг/кг) и флударабина (180 мг/м2). Все пациенты ппроходили профилактику оРТПХ с применением ПТЦф. Для реципиентов, трансплантированных от HLA-совместимых по 10/10 антигенов неродственных доноров (MUD), профилактика РТПХ включала сочетание циклофосфамида (50мг/кг) в день +3,+4; такролимус с целевой концентрацией 5-15 нг/мл в сроки от дня +5 дня +120 и микофенолята мофетила (MMF) в дозе 30 мг/кг, или 45 мг/кг для доноров, совместимых по 8-9/10 антигенам (MMUD) – со дня +5 до дня+35. В случаях трансплантации костного мозга от родственных совместимых доноров (MRD) профилактика РТПХ была с применением одного агента – циклофосфамида (50 мг/кг) в день +3 и +4. Для исследования крови, 10 мл ЭДТА-стабилизированной венозной крови получали от больных в сроки -7, 0, +7, +21 и +28 сут. Образцы плазмы получали центрифугированием при 1000 g, а затем хранили аликвоты при -80°C до анализа. Мы изучали в плазме 5 биомаркеров, а именно IL-17A, IL-6, IL-8, TNF-α и IFN-γ. Уровни цитокинов в плазме определяли с помощью ИФА, с применением коммерческих наборов («Цитокин», Санкт-Петербург, Россия). Все анализы проводили в соответствии с протоколами от производителя. Концентрации цитокинов измеряли без информации о клинических данных пациентов.

Результаты

Из 60 больных , включенных в исследование, у 20 реципиентов развилась оРТПХ различной степени (I-IV), тогда как у 40 больных РТПХ не отмечалась. Восемь из этих 20 паиентов (40%) имели РТПХ I степени; 7 (35%) – II степени; 5 (25%) – III степени. У 6 пациентов (30%) развилась системная оРТПХ. Нами не выявлено различий в концентрациях цитокинов между группами с РТПХ и без нее. Уровни всех исследованных цитокинов не коррелировали с риском развития РТПХ I-IV степени. Мы не выявили достоверных различий по цитокинам в этих группах в любые сроки наблюдения (p>0.05). Интересно, что дополнительные сравнения между группами с системной РТПХ и без РТПХ показали снижение уровней некоторых цитокинов в плазме у пациентов с РТПХ. Так, снижение среднего уровня у больных с РТПХ показано для IL-8 (соответственно, 98,74±39,47 против 276,09±284,78 пг/мл, p=0,008), и IFN-γ (22,69±16,35 против 60,07±42,00 пг/мл, p=0.005) в день +28, что явилось существенным фактором риска развития острой РТПХ. С помощью ROC-анализа были определены граничные пороги (cut-off values) для IL-8 (147,09 пг/мл; AUC= 0,833) и для IFN-γ (35,94 пг/мл; AUC= 0.848). Частота возникновения системной оРТПХ была значительно выше у пациентов с уровнями цитокинов ниже граничных порогов (0% против 35,3%, p=0.002, и 3,8% против 38,5%, p=0,003, соответственно, IL-8 и IFN-γ).

Выводы

В целом, наше пилотное исследование показало, что временная динамика уровней цитокинов после профилактики оРТПХ с применением циклофосфамида (ПТЦф) может отличаться от таковой при обычной иммуносупрессивной терапии. Также показано, что хорошо известные прогностические маркеры могут не работать после ПТЦф. Дальнейшие проспективные исследования могут прояснить эти различия и определить надежные прогностические признаки острой РТПХ. Кроме того, может быть важным введение дополнительных временных точек для взятия крови перед назначением профилактики ПТЦф.

Ключевые слова

аллогенная трансплантация гемопоэтических клеток, циклофосфамид, профилактика РТПХ, цитокины, плазма крови