Изменения свойств мультипотентных мезенхимных стромальных клеток при взаимодействии с аллогенными лимфоцитами in vitro

Резюме

Введение

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) обладают иммуномодулирующими свойствами и успешно применяются в терапии аутоиммунных заболеваний и для лечения острой и хронической реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток. Терапия с помощью МСК не всегда бывает эффективной. Показано, что иммуномодулирующие свойства МСК можно повысить с помощью различных агентов, таких как ИФН-γ, ФНО-α, ИЛ-17. Характеристики МСК при попадании в организм пациента отличаются от тех, которые изучены в культуре, за счет взаимодействия с другими клетками в кровяном русле и тканях. В данной работе была предпринята попытка смоделировать in vitro взаимодействие обработанных ИФН-γ и необработанных этим цитокином МСК с аллогенными лимфоцитами. Целью работы была оценка изменений свойств МСК после обработки ИФН-γ при контакте с лимфоцитами in vitro и определить уровень экспрессии CD90 (Thy-1) – маркера МСК, характеризующего степень их дифференцированности, в динамике.

Материалы и методы

МСК выделяли из костного мозга доноров (n=13), полученного во время эксфузии в отделении Высокодозной химиотерапии и трансплантации костного мозга ГНЦ после подписания донорами информированного согласия, и культивировали стандартным методом в среде аМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). МСК на 2-3-м пассажах рассаживали по 105 клеток на флакон с площадью дна 25 см2 и через сутки добавляли в опытные флаконы 500 ед/мл ИФН-γ на 4 часа (ИФН-γ-МСК), затем флаконы отмывали и добавляли среду RPMI-1640 c 10% ЭТС, содержащую 106 лимфоцитов стороннего донора. В половину флаконов с лимфоцитами добавляли 5 мг/мл фитогемагглютинина (ФГА) для их активации. В контрольные обработанные и необработанные ИФН-γ культуры лимфоциты не добавляли. Флаконы культивировали в течение 4-х суток после добавления лимфоцитов при 37° C и 5% CO2. Через 1, 2, 3 и 4 суток лимфоциты смывали с подслоя МСК. МСК снимали с подложки с помощью трипсина и определяли число жизнеспособных клеток методом исключения красителя (трипанового синего). Для каждой из культур МСК определялся уровень интенсивности флуоресцентного сигнала (ИФС), полученного от клеток, связавшихся с антителами анти-CD90 PE (BD Pharmingen), с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCanto II (BD Biosciences). Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка. Статистический анализ производился с помощью критерия Манна-Уитни для распределений, отличных от нормального, и Т-критерия Стьюдента (достоверными считались р < 0,05).

Результаты

Количество клеток в культурах МСК и ИФН-γ-МСК достоверно не отличалось в течение 4 суток наблюдений. Присутствие не активированных лимфоцитов не повлияло на параметры роста и жизнеспособность МСК. Ко-культивирование МСК с активированными лимфоцитами приводило к уменьшению доли жизнеспособных МСК, до 51,6±5,6% по сравнению с ИФН-γ-МСК (68,1±6,2%, р=0,02). В культурах МСК без лимфоцитов жизнеспособность составляла 74,5±4,8% на 4 сутки от начала эксперимента. Анализ ИФС CD90 показал, что в течение 4-х суток эксперимента экспрессия Thy-1 не изменяется в МСК и ИФН-γ-МСК. При совместном культивировании МСК и ИФН-γ-МСК с не активированными лимфоцитами уровень ИФС постепенно снижается в течение 4-х суток по сравнению с контрольными культурами в 1,1; 1,3 1,6 и 1,6 раза соответственно (р=0,03 на 4 сутки для МСК) и в 0,98; 1,1; 1,5; 1,7 раза (р=0,0001 для ИФН-γ-МСК). При ко-культивировании МСК с активированными лимфоцитами уровень ИФС CD90 снижается быстрее в 1,3; 1,2; 1,5 и 2,3 раза (р=0,00001 для МСК) и в 1,1; 1,1; 1,6 и 2,1 раза (р=0,002 для ИФН-γ-МСК), что свидетельствует о возможной индукции дифференцировки в МСК после контакта с лимфоцитами.

Заключение

Полученные данные показывают, что обработка ИФН-γ МСК не приводит к изменению их ростовых характеристик, однако ИФН-γ-МСК обладают большей устойчивостью к воздействию активированных лимфоцитов, что делает их более эффективным средством для клеточной терапии.

Ключевые слова

мезенхимные стволовые клетки, аллогенные лимфоциты, стимуляция ifn-γ, культура клеток