ISSN 1866-8836
Клеточная терапия и трансплантация

Использование экспрессии гранзима В в Т регуляторных клетках у пациентов с «классической» иммуносупрессией на +30 день после алло-ТГСК в качестве предиктора развития острой реакции «трансплантат против хозяина»

Михаил Ю. Дроков, Елена Н. Паровичникова, Юлия О. Давыдова, Лариса А. Кузьмина, Ирина В. Гальцева, Николай М. Капранов, Вера А. Васильева, Дарья С. Дубняк, Ольга М. Королева, Екатерина Д. Михальцова, Наталья Н. Попова, Валерий Г. Савченко
Национальный гематологический научный центр, Москва, Россия 
doi 10.18620/ctt-1866-8836-2016-5-3-22-25
Отправлено 01 Августа 2016
Одобрено 20 Сентября 2016

Загрузить версию в PDF

Клеточная терапия и трансплантация (КТТ)
Том 5, Номер 3
Contents 

Резюме

Введение

Гранзим В представляет собой сериновую протеазу широко встречающуюся в гранулах цитотоксических Т лимфоцитов и натуральных киллеров. Он секретируется совместно с формирующим поры белком перфорином, что приводит к индукции апоптоза в клетках-мишенях. Цитолиз клеток опосредуемый гранзимом В, является одним из механизмов, который используют Т регуляторные клетки (Трег) для воздействия на цитотоксические лимфоциты. Несмотря на хорошо известный факт, что Трег участвуют в патогенезе острой реакции трансплантат против хозяина (оРТПХ) и их количество после алло-ТГСК обратно коррелирует с вероятностью развития оРТПХ, данные о функциональном состоянии Трег при оРТПХ по-прежнему ограничены.

Пациенты и методы

Образцы периферической крови от 29 больных с гемобластозами отбирали в пробирки с ЭДТА на +30 день после алло-ТГСК. В связи с выраженной лимфопенией, что затрудняло анализ субпопуляции Трег, у этой группы пациентов для исследования выделяли достаточное количество мононуклеаров на градиенте плотности (ρ=1,077 г/ мл). В первую группу - без каких-либо проявлений оРТПХ за время наблюдения было включено 22 пациента (ОМЛ n=12, ОЛЛ n= 5, ЛПЗ n= 1, ХМЛ n= 2, АА n= 1, МДС n= 1). Из них 17 алло-ТГСК были выполнены от неродственных совместимых доноров, в 5 случаях - от неродственных несовместимых доноров. В 17 случаях был использован миелоаблативный режим, 5 пациентам был проведен режим кондиционирования пониженной интенсивности. Во вторую группу пациентов, с развитием оРТПХ после дня +30, были включены 7 пациентов: с ОМЛ (n= 4) и ОЛЛ (n = 3). Из них в 5 случаях алло-ТГСК проводилась от неродственного совместимого донора, в одном – от неродственного несовместимого донора, и у 1 пациента донором был HLA-идентичный сиблинг. Двум пациентам был проведено миелоаблативное кондиционирование, а 5 пациентам - режим с пониженной интенсивностью. Все пациенты в обеих группах получали стандартную профилактику РТПХ (ММФ + ЦСА + АТГ). У всех пациентов во второй группе (с оРТПХ после +30 дня) была констатирована оРТПХ II-IV степени (II (n = 1); III (n = 4); IV (n = 2)). Медиана развития РТПХ составила 50 сут. (34-150). Для определения доли гранзим В-позитивных Трег были использованы антитела к CD4-АРС-Cy7, CD25-APC, CD127FITC и Granzyme B-PE (Becton Dickinson, USA). Учитывая наличие нескольких методов для идентификации Трег: а именно как CD4+CD25high и CD4+CD25highCD127low популяции, с целью сравнения этих двух способов измерения нами предварительно был выполнен анализ по методу Блэнда-Алтмана. Сравнительный анализ этих результов не показал различий по этим двум методам при измерении доли гранзим В-позитивных Трег (р = 0,942). В связи с этим, в дальнейших экспериментах, с целью повышения воспроизводимости результатов, Трег идентифицировались как клетки с фенотипом CD4+CD25high (Gregg et al., 2005). Для достижения достаточной статистической мощности анализировали 30000 CD4+ клеток. Анализ проводили на проточном цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США).

Результаты

Из рис. 1 видно, что доля гранзим В-позитивных Трег была выше у пациентов, у которых не наблюдалась оРТПХ. На рис. 2 видно, что доля гранзим В-положительных Трег в группе пациентов, у которых не было отмечено признаков оРТПХ, составила 7,26 ± 1,89%, будучи достоверно выше, чем в группе с оРТПХ (2,04 ± 0,93%; р=0,02). Следует отметить, что, согласно нашему предыдущему анализу, бактериальная и/или вирусная инфек- ция, а также различие по HLA не оказывают влияние на долю гранзим В-позитивных Трег после алло-ТГСК. Далее нами была выполнена попытка использования доли гранзима В в Трег как прогностического маркера оРТПХ после +30 дня. На рис. 3 отображены результаты ROC-анализа. По нашим данным, показатель AUC («площадь под кривой») составил 0,74.

Выводы

Согласно полученным нами данным, доля Гранзим В-позитивных Трег у пациентов со стандартной профилактикой, может быть использована для прогнозирования оРТПХ после +30 дня с удовлетворительными результатами (AUC: 0,74; «cut-off»: 4,15%; чувствительность: 85,71%; специфичность: 45,45%). По данным нашего трансплантационного центра за 2006-2016 год, анализ экспрессии гранзима В в Трег как прогностического маркера позволяет предсказать до 47,3% случаев оРТПХ.

Ключевые слова

алло-тгск, гранзим в, т-регуляторные клетки, ортпх, прогностический маркер


Возврат к списку