ISSN 1866-8836
Клеточная терапия и трансплантация

Полимерные микро- и наноносители в качестве универсальной платформы для доставки биологически активных веществ в терапевтически релевантные популяции клеток

Альберт Р. Муслимов1,3,5, Татьяна В. Машель6, Алексей А. Пельтек6, Михаил А. Трофимов5, Игорь С. Сергеев5, Яна В. Тараканчикова4,5, Александр А. Гончаренко5, Кирилл В. Лепик1, Михаил В. Зюзин6, Александр С. Тимин1,2,3

1 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 RASA центр в Томске, Томский политехнический университет, Томск, Россия
3 Санкт-Петербургский Политехнический Университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
4 Лаборатория оптоэлектроники и измерительной техники, Университет Оулу, Оулу, Финляндия
5 Санкт-Петербургский Национальный Исследовательский Академический Университет, Санкт-Петербург, Россия
6 Санкт-Петербургский Национальный Исследовательский Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия

Резюме

Генная терапия – перспективный подходов в лечении ряда наследственных, инфекционных и онкологических заболеваний. В последнее время этот терапевтический подход получил новое развитие в связи с открытием инструментов редактирования генома. Благодаря высокой специфичности, системы РГ имеют колоссальный потенциал применения, однако, ключевым ограничением для широкого внедрения данной технологии в клиническую практику является проблема эффективной и безопасной доставки генетических конструктов внутрь релевантных клеток. Вирусные методы доставки уже используются в медицинской практике, однако с их использованием связан ряд ограничений, таких как иммуногенность, мутагенез и воспалительный ответ, а также необходимость соблюдения особых технических требований производства, обуславливающих высокую стоимость конечного продукта. Таким образом, разработка новых способов невирусной внутриклеточной доставки генетического материала является актуальной задачей.

Одним из перспективных носителей для безопасной и эффективной доставки биологически активных соединений являются полиэлектролитные микро- и нанокапсулы, полученные путем послойного нанесения биодеградируемых полимерных слоев на ядро из карбоната кальция с предварительно иммобилизированным доставляемым компонентом. В сравнении с альтернативными системами доставки, полиэлектролитные капсулы обладают рядом существенных преимуществ: высокая загружающая способность, относительная простота и дешевизна изготовления, биосовместимость, низкая токсичность, а также возможность защиты переносимого материала от агрессивного воздействия биологических сред организма. Целью данной работы являлось исследование эффективности использования полиэлектролитных капсул в качестве платформы для доставки генетического материала.

Материалы и методы

В работе были использованы капсулы, полученные путем нанесения разнозаряженных слоёв полимеров Polyarginine/Dextran sulfate (PARG/DEXS) по технологии Layer-by-Layer на ядра из карбоната кальция, полученные методом соосаждения водных растворов карбоната натрия и хлорида кальция. В качестве доставляемых генетических конструктов были использованы: плазмидная ДНК и матричная РНК (мРНК), кодирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP), мРНК, кодирующая нуклеазу TALEN, осуществляющую делецию гена dTomato, а также малые интерферирующие РНК (миРНК), угнетающие синтез GFP. Для оценки эффективности доставки генетического материала посредством полиэлектролитных капсул были использованы клеточные линии HEK293T_dTomato, HeLa, Mk4, а также первичные клеточные культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и макрофагов человека.

Результаты

В ходе исследований была разработана платформа для внутриклеточной доставки генетического материала в виде полиэлектролитных капсул размером 300-500 нм. Данные носители продемонстрировали низкую цитотоксичность (жизнеспособность более 90%) при использовании капсул в соотношении с клетками 25:1. Эффективность трансфекции клеток линии НЕК293T dTomato и клеточной культуры МСК человека составила 70% для матричной РНК и 40% для плазмидной ДНК, кодирующих GFP. В эксперименте с доставкой мРНК в первичные макрофаги человека эффективность трансфекции составила 60%. При трансфекции клеток линии HEK293T dTomato мРНК, кодирующими нуклеазу TALEN, нокаут гена dTomato наблюдался у 70% клеток. В эксперименте с миРНК подавление синтеза GFP было зарегистрировано у 98% клеток линий НЕК293T HeLa и MK4 в течение 48 часов после трансфекции.

Выводы

В ходе работы полиэлектролитные капсулы показали высокую эффективность доставки генетического материала в клетки in vitro, наряду с низкой токсичностью процедуры трансфекции. Следует отметить, что трансфекция посредством капсул является простой в исполнении процедурой, не требующей специального оборудования и сред. В дальнейшем планируется проведение экспериментов по доставке клинически релевантных генетических конструктов в клетки сложно поддающиеся трансфекции, а также исследования возможности использования полиэлектролитных капсул для доставки генетического материала in vivo.

Благодарность

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-015-00098. Александр С. Тимин также благодарит грант РФФИ № 18-015-00100. Кирилл В. Лепик также благодарит грант РФФИ № 19-29-04025.

Ключевые слова

Полимерные капсулы, невирусные системы доставки, трансфекция клеток, нуклеиновые кислоты, биологически активные вещества, инкапсуляция.


Том 8, Номер 3
30.09.2019

Загрузить версию в PDF

Возврат к списку