Горизонтальный перенос химерного транскрипта BCR-ABL р210 между лейкозными и стромальными клетками костного мозга, опосредованный экзосомами, в модели in vitro
Анна Н. Парфененкова, Ильдар М. Бархатов, Антон А. Кремлев, Борис. В. Афанасьев
НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
Резюме
Ключевой задачей молекулярно-генетических исследований в онкогематологии является анализ молекулярных маркеров, характерных для трансформированных клеток, с целью диагностики заболеваний, а также своевременной оценки их прогреcсии и риска развития рецидива. Одним из перспективных объектов для изучения, предположительно содержащих такие маркеры, являются экзосомы – мембранные везикулы, размеры которых находятся в интервале от 30 до 150 нм. Экзосомы являются важными участниками межклеточных взаимодействий и способны к переносу различных биополимеров, которые также потенциально могут оказать влияние на интерпретацию оценки минимальной остаточной болезни. Поскольку основная роль в регуляции гемопоэза принадлежит мезенхимным стромальным клеткам (МСК) костного мозга, мы предполагаем, что возможным источником выявляемого транскрипта онкогена могут в том числе выступать как персистирующие в костном мозге экзосомы, так и их миграция в клетки стромального микроокружения.
Объекты и методы
Выделение экзосом производили методом дифференциального ультрацентрифугирования кондиционной среды культуры клеток хронического миелоидного лейкоза линии К562. Полученные частицы анализировали методом лазерной корелляционной спектроскопии. Для проверки стабильности частиц и способности их взаимодействия с биологическими системами был определен Дзета-потенциал. Эксперимент по переносу химерного транскрипта проводился в 24-луночном планшете. После этого вносили 300 мкл бессывороточной питательной ростовой среды с экзосомами (выделенных с порядка 70 млн клеток на лунку).
Кокультивирование К562 и МСК проводили в 24-луночном планшете с полунепрониаемыми перегородками (диаметр пор – 0,4 мкм).
Результаты
Наибольшее количество везикул в пробе соответствует размерам экзосом. Результаты исследования показали, что распределение среднего размера проб по диаметру находится в диапазоне 51,8÷107,0 нм со средним значением 78,96±20,03 нм. Дзета-потенциал соответствует стабильным частицам и в среднем равен – 29,3±7,4 мВ. По результатам количественной ПЦР в режиме реального времени содержание химерного транскрипта BCR-ABL p210 в экзосомах колебалось в интервале 44÷864 копий/мл кондиционной среды со значением медианы 154 копии. После кокультивирования К562 и МСК относительное содержание BCR-ABL р210 в клетках-мишенях стало равным 0,03÷11,4% относительно ABL1 с медианой в 0,29%. В результате трансфекции экзосомами относительное содержание химерного транскрипта в МСК здоровых доноров находилось в интервале 0,01÷15,88% с медианой 0,11%, что соответствует положительному результату при определении МОБ и доказывает непосредственное участие экзосом в переносе.
Выводы
Экзосомальная фракция микровезикул К562 содержит химерный транскрипт BCR-ABL p210, маркер ХМЛ, и способна к его трансферу в МСК костного мозга здоровых доноров, что было определено во время экспериментов совместного культивирования клеток, а также посредством прямой трансфекции экзосомами. Количество транскрипта, перенесенного в стромальные клетки, сравнимо с таковым у пациентов с МОБ, что доказывает потенциальную возможность экзосом вносить вклад в результаты ее определения.
Ключевые слова
Внеклеточные везикулы, экзосомы, опухолеспецифичные экзосомы, стромальные клетки костного мозга, межклеточные взаимодействия.
