Новый способ введения ДМСО повышает сохранность криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток

Резюме

Введение

Обеспечение высокой и прогнозируемой сохранности гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после их размораживания и проведения аутологичной трансплантации – одно из ключевых условий для дальнейшего успешного восстановления гемопоэза после высокодозной химиотерапии у пациентов с гемобластозами. Считается, что методика криоконсервирования ГСК давно отработана и приводит к ожидаемым результатам, поэтому обычно учитывается только заготовленная доза ГСК. Однако, при использовании современного и достоверного контроля качества, повсеместно применяемые методы криоконсервации ГСК не всегда могут гарантировать достаточную сохранность данных клеток (Табл. 1). Общеизвестно, что сохранность ГСК при хранении обеспечивает криопротектор, защищающий клетки от осмотического шока при их замораживании. Криопротектор с ДМСО общепринято вводить при помощи шприца в трансплантат ГСК. При этом конечная концентрация ДМСО в 5-10% достигается уже в криопакете с трансплантатом. Однако криопротектор с концентрированным ДМСО (более 50%) при контакте с клеткой, ввиду своих физико-химических свойств, может привести к ее частичной деструкции еще до замораживания. Таким образом, повысить сохранность ГСК можно снизив деструктивное воздействие, которое может быть связано с исходной высокой концентрацией ДМСО в криопротекторе. Для этого нами разработан и апробирован новый способ введения ДМСО в трансплантат ГСК при помощи специального сконструированного аппарата – автоматизированной системы введения ДМСО (на стадии патентования). Принцип действия данной системы исключает продолжительный контакт концентрированного ДМСО с трансплантатом ГСК.

Цель

Цель работы состояла в сравнении сохранности ГСК при использовании автоматизированного и ручного способа введения ДМСО.

Материалы и методы

Лейкоконцентрат ГСК периферической крови (n=25), полученный путем афереза у пациентов с онкогематологическими заболеваниями. Контрольная группа I – введение ДМСО в криопакет с трансплантатом ГСК выполняли ручным способом. Опытная группа II – введение ДМСО в трансплантат ГСК выполняли новым автоматизированным способом. Использовали стандартный криопротектор (55% DMSO Dex 40), конечная концентрация ДМСО – 7,5%. Замораживание (одновременно группы I и II) проводили на программном замораживателе по валидированной 6-ти ступенчатой программе. Хранение осуществляли в жидком азоте. Размораживание криопакетов проводили на водяной бане при +40 в течение 1 мин. Анализ количества жизнеспособных ГСК и их суммарной колониеобразующей активности (КОЕ) выполнялся до и после введения криопротектора, а также после размораживания. После размораживания для достоверности пробы отбирались из криопакетов. Количество ГСК оценивалось по фенотипу CD34+/CD45dim/7AAD проточной цитометрией по протоколу ISHAGE. Колониеобразующая активность ГСК оценивалась путем их культивирования в течение 14 суток (Methocult H4435) с последующим подсчетом суммарных колоний (КОЕ).

Результаты

Согласно представленным в таблице 2 результатам, сохранность ГСК в группах I и II после введения ДМСО не отличается. Идентичные результаты, вероятно, обусловлены одинаковым инкубационным воздействием ДМСО на ГСК, связанным с продолжительностью проведения анализа методом проточной цитометрии. Тем самым моделируется экспозиционное воздействие ДМСО на ГСК. Из этого следует, что при отсутствии немедленного замораживания ГСК после введения ДМСО, повреждающие эффекты связаны с деструктивными физико-химическими свойствами ДМСО по отношению к клеткам, причем не зависимо от способа введения ДМСО.
Общепринято немедленно замораживать трансплантат сразу после введения ДМСО. В этот короткий временной промежуток будут законсервированы только те повреждения клеток, которые проявились сразу после первичного воздействия ДМСО. Поэтому зависимость контроля качества сохранности ГСК после введения криопротектора по методу 2 может быть оценена с большей достоверностью после размораживания. Контроль качества после размораживания отражен на рис. 1. Согласно представленным на рисунке результатам, сохранность ГСК после размораживания достоверно выше на 14% (p≤0.05) при использовании автоматизированной системы в сравнении с ручным способом. При прочих равных условиях исследования, суммарные потери ГСК после размораживания при ручном способе составили в среднем 20%, при автоматизированном – 6%. Они включают потери ГСК при введении ДМСО, а также утрату ГСК в процессе замораживания. Поэтому потери, вызванные замораживанием, можно принять как одинаковые при использовании разных способов введения ДМСО. Следовательно, при ручном способе потери связаны с этапом введения ДМСО. Мы полагаем, что средняя сохранность в 94% обусловлена способом введения ДМСО с использованием автоматизированной системы. Принцип работы автоматизированной системы позволяет снизить одномоментное повреждающее влияние исходного концентрированногораствора ДМСО на ГСК и обеспечить его более плавное разбавление до необходимой конечной концентрации ДМСО в 7,5%. Результаты, представленные в таблице и на рисунке, также показывают, что ДМСО на этапе его введения при экспозиции может оказывать большее негативное воздействие на ГСК, чем процедура замораживания трансплантата.

Заключение

Сохранность ГСК при использовании автоматизированной системы введения ДМСО достоверно (на 14%) выше в сравнении с ручным способом.

Ключевые слова

Гемопоэтические стволовые клетки, криоконсервация, димитилсульфоксид, аутологичная трансплантация.

Рисунок 1. Выход гемопоэтических клеток после ручного или автоматизированного введения ДМСО и криоконсервирования по различным критериям