Влияние посттрансплантационного циклофосфамида на химеризм в популяции Т-регуляторных клеток у пациентов после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток

Резюме

Введение

Главной причиной развития аллоиммунных осложнений после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) является проблема иммунологической несовместимости пары донор-реципиент. Т-регуляторные клетки (Т-рег) играют важную роль в поддержании толерантности после трансплантации. Известно, что именно эта популяция клеток препятствует развитию острой реакции трансплантат против хозяина (оРТПХ). Активация Т-клеток после алло-ТГСК происходит преимущественно на +3,+4 день и связана с распознаванием Т-клетками пептидов, презентируемых донорскими («прямое аллогенное распознавание») или хозяйскими («непрямое аллогенное распознавание») антиген-презентирующими клетками. В настоящее время у больных гемобластозами после алло-ТГСК с целью преодоления иммунологической несовместимости пары донор-реципиент широко применяется циклофосфамид в дозе 50 мг/кг на +3, +4 день после трансплантации (пост-ЦФ). Как известно, его использование ведет к делеции аллореактивных Т-клеток эффекторов в эти сроки, что же касается других субпопуляций Т-клеток, то его влияние на них изучено недостаточно. Целью работы была оценка влияния пост-ЦФ на химеризм в популяции Т-рег у пациентов после алло-ТГСК.

Пациенты и методы

В исследование были включены 27 пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга (ОЛЛ n=6, ОМЛ n=20, ХММЛ n=1). Подробная характеристика групп представлена в Таблице 1. На +30 день после алло-ТГСК у всех пациентов, вошедших в данное исследование, был произведен забор периферической крови. Далее было проведено выделение мононуклеаров с использованием градиента плотности фиколла (1,077 г/л). Посредством высокоактивной магнитной сепарации (CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Германия) была выделена популяция клеток, имеющих фенотип CD4+CD25+, который преимущественно ассоциирован с Т-рег клеткам. На данном этапе у части пациентов был выполнен контроль чистоты обогащенной популяции с использованием проточной цитометрии (Рис. 1). Далее из полученной клеточной суспензии была произведена экстракция ДНК с использованием наборов для выделения ДНК/РНК «Ампли Прайм РИБО-преп». Химеризм в образцах ДНК определялся при помощи метода STR-PCR (полимеразная цепная реакция с панелью праймеров к локусам коротких тандемных повторов (short tandem repeat) человека. Процент донорского химеризма вычислялся с помощью стандартных формул. Статистический анализ данных проводился с использованием SPSS ver 23. (IBM, Chicago,Ill., USA). Для оценки статистической значимости различий между двумя независимыми выборками использовался U-критерий Манна-Уитни. Для анализа таблиц сопряженности 2×2 использовался точный тест Фишера. Различия признавались значимыми при p<0,05.

Результаты

Данные по химеризму в популяции Т-рег представлены на Рис. 2. Показано, что при использовании пост-ЦФ на +3,+4 день в Т-рег доля хозяйского кроветворения значимо ниже (р=0,03*), чем у пациентов, которым проводилась стандартная иммуносупрессивная терапия. При применении пост-ЦФ медиана доли Т-рег с хозяйским генотипом (с межквартильным интервалом) составила 0% (0-2,5%), при применении стандартной иммуносупрессивной терапии – 10% (5-27%).

Заключение

Широкое применение пост-ЦФ позволило достичь значительного снижения частоты РТПХ даже у пациентов с выраженными различиями по системе HLA. Однако механизмы, которые приводят к этим эффектам, до конца не известны. Наше исследование показывает, что использование пост-ЦФ приводит не только к делеции аллореактивных Т-клеток эффекторов на +3,+4 день после алло-ТГСК, как было показано другими авторами ранее, но также и к делеции Т-регуляторных клеток, что проявляется при их реконституции: а именно преимущественном восстановление Т-рег за счет клеток донорского генотипа в группе пост-ЦФ.

Ключевые слова

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, высокодозный циклофосфамид, химеризм, Т-регуляторные клетки, реакция трансплантат против хозяина.