ISSN 1866-8836
Клеточная терапия и трансплантация

Применимость и универсальность формул для мониторинга химеризма с учетом статтер-пиков ПЦР

Наталья С. Кострица1, Наталья В. Рисинская2, Андрей Б. Судариков2, Елена Н. Паровичникова2, Валерий Г. Савченко2
1Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного
университета имени М. В. Ломоносова
2ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр гематологии МЗ России, г. Москва

Загрузить версию в PDF

Клеточная терапия и трансплантация (КТТ)
Том 6, Номер 3
Contents 

Резюме

Введение

Мониторинг химеризма – основной способ контроля процесса приживления трансплантата после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Амплификация коротких тандемных повторов (short tandem repeats, STR-ПЦР) используется в качестве рутинного метода определения химеризма и основывается на различной длине STR в геномах донора и реципиента. Образование более коротких, чем основной продукт (как правило, на 4 нуклеотида короче), побочных продуктов реакции (так называемых статтер-пиков), которые могут совпадать со специфическими метками реципиента – уменьшает количество информативных меток и осложняет подсчет химеризма. Ранее мы показали, что вклад статтер-пика в общее количество ДНК является индивидуальной константой в каждом аллеле для каждого пациента, в связи с чем были получены формулы для вычисления химеризма с учетом статтер-пиков (Кострица Н. и др., сборник тезисов к конференции «Ломоносов-2017»). Также была доказана корректность использования данных формул и их равнозначность классическим (р<0,05). Цель исследования: проверка универсальности данных формул для разных аллельных статусов, в том числе для случая, когда в гетерозиготе статтер неинформативного аллеля донора совпадает с информативным аллелем реципиента. Формулы можно считать универсальными в том случае, если отношение статтера 1 как к пику 1, так и к пику 2 гетерозиготы является постоянным.

Материалы и методы

В исследование включены 20 образцов ДНК. Для STR-ПЦР геномной ДНК из костного мозга использовали COrDIS Plus – мультиплексный набор для амплификации 19 полиморфных STR-маркеров и локуса амелогенина человека. Фрагментный анализ проводили на анализаторе нуклеиновых кислот 3130 Genetic Analyzer. Обработку данных проводили с использованием программного обеспечения GeneMapper v.4-0. Информативные локусы были выбраны ранее путем сравнения ДНК пациента до трансплантации и ДНК донора. По стандартным формулам были вычислены отношения статтер 1/пик 1 и статтер 1/пик 2 в гетерозиготе. Дисперсию этого отношения для каждого локуса и пациента затем сравнивали с таковой для вклада статтера в общее количество продукта.

Результаты

На основе анализа 20 меток в 7 временных точках были получены индивидуальные дисперсии для каждого локуса и пациента при повторных измерениях, а затем посчитана средняя дисперсия: 0,01 для отношения статтер-пика с «своему» пику в гетерозиготе и 0,014 для отношения статтер-пика к другому пику гетерозиготы, при том, что дисперсия для вклада статтеров в общую ДНК по предыдущему исследованию составляет 0,01 (Рис. 2). Таким образом, не только вклад статтеров в общую ДНК, но и отношение статтера к любому из пиков гетерозиготы, можно считать индивидуальной константой для каждого локуса и пациента и использовать при расчете химеризма, однако в случае использования статтера 1 и пика 2 необходимо увеличить порог чувствительности до 1,5%. При небольших значениях смешанного химеризма использовать такие метки не рекомендуется. Расчет для случая А на Рис. 2 будет производиться по формуле 2 (Рис. 1), а для случаев 2 и 3 по формуле 1 (Рис. 1), как для гомозиготы, поскольку совпадающий пик в данном случае не учитывается.

Заключение

Полученные формулы (Рис. 1) универсальны для различных аллельных статусов, поскольку отношение любого статтера к любому основному пику в гетерозиготе является константой, что связано с определенной вероятностью ошибки ДНК-полимеразы, постоянной для каждой конкретной последовательности. Однако из-за случайных колебаний количества продукта для отношения статтер 1/пик 2 ошибка несколько больше, чем для отношения статтер 1/пик 1. Таким образом, статтер-пики не являются препятствием для корректого расчета химеризма. При расчетах в качестве константы рекомендуется использовать вклад статтеров в общее количество продукта в данном локусе или отношение
статтера к продукту аллеля, на котором он был получен при ошибке ДНК-полимеразы.

Ключевые слова

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, химеризм, короткие тандемные повторы, статтер-пик.

Возврат к списку