Применимость и универсальность формул для мониторинга химеризма с учетом статтер-пиков ПЦР
Наталья С. Кострица1, Наталья В. Рисинская2, Андрей Б. Судариков2, Елена Н. Паровичникова2, Валерий Г. Савченко2
1Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного
университета имени М. В. Ломоносова
2ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр гематологии МЗ России, г. Москва
университета имени М. В. Ломоносова
2ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр гематологии МЗ России, г. Москва
Резюме
Введение
Мониторинг химеризма – основной способ контроля процесса приживления трансплантата после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Амплификация коротких тандемных повторов (short tandem repeats, STR-ПЦР) используется в качестве рутинного метода определения химеризма и основывается на различной длине STR в геномах донора и реципиента. Образование более коротких, чем основной продукт (как правило, на 4 нуклеотида короче), побочных продуктов реакции (так называемых статтер-пиков), которые могут совпадать со специфическими метками реципиента – уменьшает количество информативных меток и осложняет подсчет химеризма. Ранее мы показали, что вклад статтер-пика в общее количество ДНК является индивидуальной константой в каждом аллеле для каждого пациента, в связи с чем были получены формулы для вычисления химеризма с учетом статтер-пиков (Кострица Н. и др., сборник тезисов к конференции «Ломоносов-2017»). Также была доказана корректность использования данных формул и их равнозначность классическим (р<0,05). Цель исследования: проверка универсальности данных формул для разных аллельных статусов, в том числе для случая, когда в гетерозиготе статтер неинформативного аллеля донора совпадает с информативным аллелем реципиента. Формулы можно считать универсальными в том случае, если отношение статтера 1 как к пику 1, так и к пику 2 гетерозиготы является постоянным.Материалы и методы
В исследование включены 20 образцов ДНК. Для STR-ПЦР геномной ДНК из костного мозга использовали COrDIS Plus – мультиплексный набор для амплификации 19 полиморфных STR-маркеров и локуса амелогенина человека. Фрагментный анализ проводили на анализаторе нуклеиновых кислот 3130 Genetic Analyzer. Обработку данных проводили с использованием программного обеспечения GeneMapper v.4-0. Информативные локусы были выбраны ранее путем сравнения ДНК пациента до трансплантации и ДНК донора. По стандартным формулам были вычислены отношения статтер 1/пик 1 и статтер 1/пик 2 в гетерозиготе. Дисперсию этого отношения для каждого локуса и пациента затем сравнивали с таковой для вклада статтера в общее количество продукта.Результаты
На основе анализа 20 меток в 7 временных точках были получены индивидуальные дисперсии для каждого локуса и пациента при повторных измерениях, а затем посчитана средняя дисперсия: 0,01 для отношения статтер-пика с «своему» пику в гетерозиготе и 0,014 для отношения статтер-пика к другому пику гетерозиготы, при том, что дисперсия для вклада статтеров в общую ДНК по предыдущему исследованию составляет 0,01 (Рис. 2). Таким образом, не только вклад статтеров в общую ДНК, но и отношение статтера к любому из пиков гетерозиготы, можно считать индивидуальной константой для каждого локуса и пациента и использовать при расчете химеризма, однако в случае использования статтера 1 и пика 2 необходимо увеличить порог чувствительности до 1,5%. При небольших значениях смешанного химеризма использовать такие метки не рекомендуется. Расчет для случая А на Рис. 2 будет производиться по формуле 2 (Рис. 1), а для случаев 2 и 3 по формуле 1 (Рис. 1), как для гомозиготы, поскольку совпадающий пик в данном случае не учитывается.Заключение
Полученные формулы (Рис. 1) универсальны для различных аллельных статусов, поскольку отношение любого статтера к любому основному пику в гетерозиготе является константой, что связано с определенной вероятностью ошибки ДНК-полимеразы, постоянной для каждой конкретной последовательности. Однако из-за случайных колебаний количества продукта для отношения статтер 1/пик 2 ошибка несколько больше, чем для отношения статтер 1/пик 1. Таким образом, статтер-пики не являются препятствием для корректого расчета химеризма. При расчетах в качестве константы рекомендуется использовать вклад статтеров в общее количество продукта в данном локусе или отношениестаттера к продукту аллеля, на котором он был получен при ошибке ДНК-полимеразы.