PI-08. Выявление контаминации культур клеток микоплазмой методом цифровой капельной ПЦР

Резюме

Микоплазма – один из распространенных контаминантов клеточных культур. Небольшие размеры и устойчивость ко многим антибиотикам затрудняют ее своевременное выявление и устранение. Микоплазма, обедняя среду, угнетает клеточный рост культуры, изменяет различные свойства культивируемых клеток (метаболизм, пролиферацию, экспрессию генов), затрудняя их использование в экспериментах в качестве модельных линий и интерпретацию получаемых на контаминированных клетках результатов. В связи с этим, крайне важно контролировать наличие данного патогена в лабораториях. Метод цифровой капельной ПЦР позволяет делать это с высоким уровнем специфичности и воспроизводимости, что выступает на первый план при отсутствии альтернативных методов исследования. Целью данной работы является адаптация метода цифровой капельной ПЦР для выявления контаминации культур клеток микоплазмой, а также скрининг имеющихся в лабораториях НИИ ДОГиТ им. Р. М. Горбачевой клеточных линий человека на наличие этого микроорганизма.

Материалы и методы

В рамках данного исследования были протестированы культуры клеток К562, Raji, Hek293, THP-1с подозрением на контаминацию микоплазмой. Их аликвоты были разморожены и культивировались в соответствующих средах в течение 48 часов до выполнения анализа. После этого проводили отмывку клеток от культуральной среды путем центрифугирования и ресуспендирования в фосфатно-солевом буфере. Затем из клеток выделяли геномную ДНК с использованием технологии выделения на спин-колонках набором GeneJETGenomic DNA PurificationKit (ThermoFisher, США) по инструкции производителя. Концентрацию и качество выделения ДНК измеряли с использованием прибора Nanodrop. Для выявления контаминации микоплазмой использовали набор реактивов MycoReal-Time (Евроген), в котором ДНК микоплазм выявляют методом ПЦР в реальном времени с зондами типа TaqMan, но с добавлением специфичного для цифровой капельной ПЦР набора реагентов ddPCR^TM SupermixforProbes (Bio-Rad, США). Генерацию капель и считывание флуоресценции производили на приборе QX200 AutoDGDropletDigital PCR System(Bio-Rad, США) с автоматической генерацией капель.

Результаты

С целью адаптации протокола MycoReal-Time(Евроген) для цифровой капельной ПЦР использовали следующую комбинацию реагентов на одну реакцию: 10 мкл ddPCR^TM Supermix for Probes, 5 мкл5X OligoMyco RT, 2 мкл образца ДНК клеточных линий или MycoDNA Control. Во избежание перегрузки капель ДНК, образец положительного контроля разводили в 4 раза относительно рекомендованного производителем. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Амплификацию производили по следующему протоколу: 95°С – 10 мин; (95°С – 10 сек, 60°С – 1 мин)×45 циклов. Считывание флуоресценции производили по каналу FAM. При таком протоколе успешно определяли сигнал положительного контроля из набора MycoReal-Time(Евроген). Скрининг клеточных линий лаборатории показал, что в трех проанализированных линиях (К562, HEK2963T и THP-1) из четырех обнаружена контаминация микоплазмой. Попытка устранения контаминации К562 при их культивировании в присутствии клиндамицина (900 мкг/мл) и ципрофлоксацина (120 мкг/мл) в течение 14 дней была успешной, т.е. контаминант не обнаруживался методом цифровой капельной ПЦР.

Выводы

Согласно результатам цифровой капельной ПЦР, протокол набора MycoReal-Time (Евроген) был успешно адаптирован для прибора QX200 AutoDGDropletDigital PCR System (Bio-Rad, США). Данный метод может на рутинной основе использоваться в лабораториях НИИ ДОГиТ им. Р. М. Горбачевой для контроля контаминации микоплазмой культивируемых клеточных линий и первичных культур клеток человека.

Ключевые слова

Микоплазма, контаминация, клеточные культуры, ДНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР), цифровая капельная ПЦР.