GC-05. Повышение эффективности длинных целевых вставок в геном клеток человека с использованием TALEN платформы редактирования и невирусных методов доставки для генной терапии социально значимых заболеваний

Резюме

Генная терапия на основе трансплантации генетически модифицированных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСПК) с помощью инженерных нуклеаз (ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9) обладает мощным потенциалом для лечения ряда моногенных заболеваний человека. Основой такого метода лечения является вставка здоровой копии участка ДНК или целого трансгена в локус двуцепочечного разрыва, формируемого нуклеазой, доставляемого в виде донорской матрицы в различной форме. Известно, что важным фактором, влияющим на эффективность вставки, является структура и длина вносимой в клетку донорской ДНК-матрицы. Среди многих ее форм (одно- или двуцепочечная ДНК, кольцевая или линейная, вирусная или невирусная и т.д.) линейная двуцепочечная линейная ДНК представляет интерес для преклинической разработки геннотерапевтических клеточных продуктов, благодаря потенциальной эффективности и простоте производства. Ограничивающим фактором их применения является токсичность для первичных клеток человека, зависящая структурных параметров матриц [Paludan et al., 2013; Kath et al., 2022]. Целью данной работы является оптимизация структуры вносимой в клетку донорской матрицы в форме линейной двуцепочечной ДНК, используемой для гомологичной репарации TALEN-опосредованных целевых разрывов в ДНК, с целью повышения эффективности редактирования/вставки терапевтических трансгенов в клеточных линиях человека, являющихся наиболее приближенными моделями ГСПК.

Материалы и методы

Синтез различных вариантов донорских линейных ДНК-матриц проводили методом ПЦР плазмидной ДНК, кодирующей тансген GFP и домены гомологии к локусу CCR5 в месте формирования двуцепочечного разрыва длиной 400 пар нуклеотидов. Трансфекцию клеток К562 проводили в концентрации 3,3*10⁶/мл клеток по заранее отработанному протоколу двухэтапной электропорации с использованием электропоратора Gene Pulser Xcell System (Bio-Rad, США). Концентрация мРНК при трансфекции составляла 25 мкг/мл. Концентрация донорских матриц составляла 20 мкг/мл. Исследовали следующие модификации донорских матриц: добавление в состав последовательности донорской матрицы последовательности, ингибирующей сенсоры внутриклеточного иммунного ответа на экзогенную ДНК или повреждение геномной ДНК (TLR9/AIM2/cGAS) – А151, а также стабилизация концов донорской матрицы фосфоротиоатными связями. Эффективность вставки трансгена и жизнеспособность клеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии.

Результаты

В ходе работы был отработан протокол двухэтапной трансфекции, обеспечивающий эффективность нокаута целевой мишени CCR5 до 85% при выживаемости клеток от 30,4 до 46,2%. Эффективность трансфекции донорской матрицы в виде двуцепочечной линейной молекулы ДНК составляла 7,1-23,6%. Согласно данным проточной цитофлуориметрии эффективность вставки трансгена к шестому дню после трансфекции составляла 6,9-13,2% в зависимости от типа модификации концов донорской матрицы и была максимальной для донорской матрицы без модификаций. В сравнении с полученными ранее предварительными данным и контрольными образцами в текущем эксперименте с использованием в качестве донорской матрицы плазмидной ДНК эффективность вставки трансгена была выше при использовании линейных ДНК-матриц – 2,6% vs. 13,2%.

Выводы

Разработка линейных двуцепочечных ДНК матриц в качестве доноров для репарации целевых разрывов в ДНК имеет перспективу для разработки геннотерапевтических клеточных продуктов для лечения моногенных заболеваний человека.

Авторы благодарят за финансовую поддержку Российский Фонд Фундаментальных Исследований, грант №19-29-04025мк.

Ключевые слова

Генная терапия, невирусная, редактирование генов, платформа ТALEN, ген CCR5.