GC-03. Эффективность лентивирусной трансдукции естественных киллерных клеток

Резюме

Активное применение генно-модифицированных естественных киллерных (ЕК) клеток ограничено методологическими сложностями доставки генетического материала в эти клетки. Одним из используемых способов модификации является лентивирусная трансдукция. Однако, ее использование ограничено выходом трансдуцированных клеток. Вирус, полученный на основе векторной кассеты VSV-G, классически используемый для создания химерных антигенных рецепторов CAR-T-клеток, не эффективно трансдуцирует ЕК-клетки. Чтобы повысить эффективность трансдукции ЕК-клеток, мы исследовали альтернативные псевдотипированные белки. Большую эффективность трансдукции показывает псевдотипированный лентивирусный вектор оболочки бабуина BaEV-TR. Он связывает входные рецепторы натрий-зависимого переносчика нейтральных аминокислот ASCT-1 и ASCT-2 и широко экспрессируется в гемопоэтических линиях. Таким образом, использование альтернативных псевдотипов лентивирусов позволит решить множество фундаментальных вопросов и выявить способы получения достаточного количества генетически модифицированных EK-клеток. Целью работы было сравнение эффективности трансдукции ЕК-клеток двумя вариантами лентивирусных частиц на основе векторных кассет BaEV-TR и VSV-G.

Материалы и методы

В работе использовали мононуклеарные клетки периферической крови двух здоровых доноров. Первичная культура ЕК-клеток была получена с использованием набора CD3-деплеции, после чего клетки культивировались в полной ростовой среде PRMI-1640 с добавлением ИЛ-2 500 ЕД, 72 часа перед трансдукцией; также были использованы два лентивирусных вектора отличных между собой плазмидой оболочки, в первом варианте использовалась pMD2.G, кодирующая поверхностный гликопротеин G вируса везикулярного стоматита VSV-G, во втором BaEV-TR, кодирующая модифицированный гликопротеин оболочки ретровируса бабуина. Плазмиды psPAX2, содержащая гены gag-pol и pUltra, кодирующая ген репортерного белка EGFP, входили в состав обоих вариантов. В культуральный планшет сажали ЕК-клетки в концентрации 2*10^5 кл/мл с ИЛ-2 200 ЕД и 10 мкг вектофузина в 0,5 мл среды. Вирусные частицы добавляли к клеткам в количестве, необходимом для достижения множественности инфекции 1, 5, 10. Далее проводили центрифугирование при 800 g, 90 минут, 37°C. После трансдукции вируса клетки инкубировали при 37°С, а смену среды проводили спустя 24 часа. Уровень трансдукции определяли методом проточной цитометрии по экспрессии репортерного белка EGFP через 72 часа.

Результаты и обсуждение

Мы сравнили эффективность трансдукции первичных ЕК-клеток двумя вариантами лентивирусных частиц на основе векторных кассет BaEV-TR и VSV-G. Проценты трансдуцированных клеток для множественности инфекции 1, 5, 10 при использовании VSV-G и BaEV-TR составили 0,28%, 1,5%, 2,8% и 50%, 62%, 70%, соответственно. Рецептор для VSV-G представляет собой липидный рецептор низкой плотности LDL-R, который практически не экспрессируется ни в покоящихся, ни в активированных ЕК-клетках [Bari et al., 2019], что объясняет низкий процент трансдукции, полученный нами. При этом рецепторы оболочки бабуина – ASCT-1 и ASCT-2 усиленно экспрессируются в ответ на активацию ЕК-клеток ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-21, что приводит к возрастанию эффективности трансдукции BaEV-TR [1] и получило подтверждение в наших результатах.

Выводы

Процент трансдуцированных ЕК-клеток лентивирусным вектором на основе кассеты BaEV-TR выше, чем на основе векторной кассеты VSV-G, что может быть в дальнейшем использовано для целей иммунотерапии на основе модифицированных ЕК-клеток.

Ключевые слова

ЕК-клетки, трансдукция, лентивирус, псевдотипированные частицы оболочки, ретровирус, бабуин.