GC-13. Сравнительная оценка условий криоконсервации клеточных культур K562 и мезенхимальных стромальных клеток
Ирина А. Сидорова, Кирилл В. Лепик, Альберт Р. Муслимов, М. А. Трофимов, Ольга С. Епифановская, Владислав С. Сергеев, Александр Д. Кулагин
НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
Резюме
Криоконсервация клеточного материала является необходимым этапом при ведении клеточных линий, а так же при создании биомедицинских клеточных продуктов (БМКП). В настоящее время актуальной задачей является устранение компонентов ксеногенного происхождения из сред для криоконсервации клеток, входящих в состав БМКП. Целью данного исследования является сравнение различных параметров криоконсервации культур и влияние их на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток.
Материалы и методы
Исследование проводилось на клеточных линии К 562 и культуре первичных мезенхимальных стромальных клеток мыши (mMSC). В исследование включены 5 групп, различающихся по составу среды для криоконсервации: a) стандартные условия – полная среда (RPMI/®-MEM+10% FBS)+10%DMSO с использованием криоконтейнера (Mr. Frosty, Nalgene, США), б) полная среда+10%DMSO без использования криоконтейнера, в) коммерчески доступная среда CryoStor® CS10 (Stem Cell Technologies, США), г) раствор SSP+ (MacoPharma, Франция) с 10% DMSO, д) негативный контроль полная среда без добавления DMSO. Каждый образец из группы исследовался в трех повторах, подвергался заморозке в течении 7 дней при температуре -80°С, в трех независимых экспериментах. После разморозки производилась оценка жизнеспособности клеток методом проточной цитофлуориметрии с добавлением витального красителя 7AAD. Проведен анализ динамики пролиферативной активности образца клеток числом 1×10^4 в исследуемых группах спектрофотометрическим методом с использованием витального красителя alamar blue через 24, 72 и 168 ч. Статистическое сравнение групп проводилось методом Мана-Уитни.
Результаты
При оценке жизнеспособности клеточной линии К562 после разморозки, медиана доли 7-AAD+ клеток составила в группе а) 1,5% (1,2-2,1), группе б) 1,6% (1,1-1,8) группе в) 1,4% (1,2-1,9), группе г) 1,4% (1,1-1,8), группе д) 4,5% (2,7-5,6). При сравнении показателей жизнеспособности не было выявлено различий между условиями а, б, в, г. Перечисленные условия обладали статистически значимым преимуществом по сравнению с негативным контролем (д) (p=0,02). При оценке жизнеспособности клеток mMSC медиана доли 7-AAD+ клеток составила в группе а) 43,8% (16-62), б) 46,0% (22-65), в) 30,2% (17-46), г) 19,7% (16-26), д) 90,1% (86-97). При сравнении выявлено статистически значимое преимущество условий а, б, в, г по сравнению с контролем д (p<0,001). Выявлено преимущество среды на основе SSP+ по сравнению с остальными условиями консервации (p<0,05). При оценке пролиферативной активности клеточной линии К562 отмечалось увеличение медианы значения интенсивности флюоресценции резоруфина через 168 ч. по сравнению со значением через 24 часов в группе а) на 39% б) на 61% в) на 67% г) на 44% д) на 23%. Все условия консервации обладали преимуществом по сравнению с группой негативного контроля (p<0,0001). Показатель флюоресценции был значимо выше в группе Cryostor по сравнению со стандартными условиями (полная среда+DMSO).
Вывод
Проведенный анализ демонстрирует отсутствие преимуществ использования криоконтейнера при заморозке исследованных клеточных типов. Криоконсервация с использованием среды Cryostor CS10 и SSP+ c добавлением DMSO продемонстрировали наибольший потенциал в отношении сохранения жизнеспособности и пролиферативной активности исследованных культур.
Ключевые слова
Криоконсервация, клеточные культуры, клеточные продукты, ДМСО.
