GC-12. Комбинируя CAR-T и биспецифические антитела: новый дизайн химерного антигенного рецептора с внеклеточным доменом CD3E для перенаправления противоопухолевой специфичности с помощью биспецифических антител

Резюме

Т-клеточная терапия с использованием рекомбинантного химерного антигенного рецептора (CAR-T) стала выдающийся терапевтической опцией для лечения некоторых В-клеточных злокачественных новообразований. Однако, примерно у половины пациентов наблюдаются рецидивы. Важным механизмом устойчивости к CAR-T терапии являются уменьшение экспрессии антигена и истощение CAR-T продукта. Большинство биспецифических Т-клеточных антител (BsAbs) связывают белок CD3-эпсилон (CD3ε) на Т-клетках вместе с ассоциированным с опухолью антигеном. Использование CD3ε в качестве внеклеточного домена CAR позволяет задействовать данный рецептор в формировании иммунных синапсов как при взаимодейстии BsAbs с Т-клеточным рецептором. CAR-T-терапия обладает непренебрежимой токсичностью – вплоть до фатальных исходов у некоторых пациентов. Наш подход потенциально нацелен на снижение токсического воздействия CAR-T путем контроля путем контроля инфузии BsAbs, а подбор специфичности возможен путем изменения BsAbs. Кроме того, возможность переведения CAR-T клеток в неактивное состояние путем прекращения инфузии BsAbs предположительно устраняет истощение клеточного продукта [1].

Материалы и методы

кДНК внеклеточного домена (ВКД) гена CD3E была получена из мРНК мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) здорового донора и клонирована в pIRES. Затем кДНК внеклеточный домен CD3E была вставлена в лентивирусную плазмиду pCDH, содержащую FMC63-CD8stalk-41bbz CAR с NGFR в качестве репортерного гена заменяя FMC63 (клон 7). Лентивирусные препараты получали с использованием клеток HEK293T и упаковывающих плазмид pMD2.G и psPAX2. Лентивирусный препарат титровали с использованием линии клеток HEK293. PBMC здорового донора выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Клетки были посажены в лунку в концентрации 1-2*10⁶ клеток/мл и активированы 0,1 мкг/мл anti-CD3 антителами (OKT3) с добавлением 50 ЕД/мл IL-2 в течение 3 дней. На 3-й день клетки были трансдуцированы лентивирусным вектором в течение 2 дней. На 5-8 день после активации с помощью проточной цитометрии клетки оценивали на экспрессию NGFR. На следующий день после определения процента NGFR-положительных клеток проводили тест на цитотоксичность: клеточную линию Raji, окрашенную CFSE, инкубировали с CAR-T-клетками в различных соотношениях в двух повторах с добавлением в различных концентрациях BsAbs (блинатумомаб или глофитамаб). Процент выживших клеток-мишеней (Raji) определяли методом проточной цитометрии через 4 или 24 часа. Цитотоксичность определяли по формуле: 100 – живые клетки/контрольные клетки живые (без эффекторов).

Результаты

Титр лентивируса составил 8×10⁴/µL на клетках HEK293T. Эффективность трансдукции составила 30-90%. Цитотоксичность при инкубации 4 и 24 часа с блинатумомабом в концентрациях 0, 10, 100 и 200 нг/мл при соотношении эффектор:мишень (Э:М) – 0,3:1, 1:1, 3:1, 5:1 статистически значимо не отличалась от контроля. Цитотоксичность глофитамаба тестировали при концентрациях 0, 1, 10 пМ/л с соотношением (Э:М) 0,3: 1, 1: 1, 5: 1 в течение 24 часов. Наибольшая цитотоксичность была в соотношении (Э:М) 5:1, где CAR-T был более эффективным, чем нетрансдуцированные Т-клетки при концентрации глофитамаба 1 пМ/л (59% против 93%) и 10 пМ/л (74% против 96%).

Вывод

Новые CAR с внеклеточным доменом CD3E, перенаправляемые BsAbs (глофитамабом), активны против В-клеточной лимфомы in vitro, но при применении блинатумомаба подобного не замечено, что можно объяснить тем, что фрагмент OKT3, на котором основан блинатумомаб, распознает CD3ε только в качестве димера, но не мономера [2-4]. Следовательно, является оправданным создание CAR с внеклеточными доменами CD3epsilon/CD3gamma и CD3epsilon/CD3delta.

Ключевые слова

CAR-T, химерный антигенный рецептор, клеточная терапия, В-клеточные опухоли, биспецифические антитела.