Лизис мезенхимальных стволовых клеток после внутривенной инфузии: роль системы комплемента и возможные стратегии предотвращения in vitro
А. Р. Муслимов, Р. Т. Михелашвили, Е. В. Волчков, К. В. Лепик, В. С. Сергеев, Б. В. Афанасьев
Институт детской гематологии, онкологии и трансплантологии имени Р. М. Горбачевой
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
Резюме
Введение
Благодаря своим биологическим свойствам, мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются одной из наиболее востребованных клеточных популяций в подходах клеточной терапии и восстановительной медицины. В настоящее время эффективность применения МСК исследуются в сотнях клинических испытаний разных фаз, в большинстве из которых используется их внутривенное системное введение. Все более остро встает вопрос о необходимости понимания распределения, жизнеспособности и функций этих клеток при внутривенной инфузии. Результаты работ последних лет демонстрируют низкую биосовместимость МСК при внутривенном способе введения, и гибель значительного числа культивируемых in vitro МСК за счет комплемент-зависимого лизиса. Данные касательно этого вопроса ограничены и зачастую противоречивы. Целью настоящего исследования является оценка жизнеспособности МСК при внутривенном введении, подтверждение наличия комплемент-индуцированного лизиса МСК и поиск возможных способов его преодоления.
Материалы и методы. МСК выделялись из образцов костного мозга здоровых доноров (n=6) методом прямого посева. Экспансия МСК от каждого из доноров проводилось на средах двух типов: на MEM-α, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и MEM-α, содержащей 7,5% лизата тромбоцитов (ЛТ). Сбор клеток для экспериментов (пассаж 1, 2) проводился при достижении конфлюентности > 80% путем обработки культуры раствором 0,25% трипсина с ЭДТА. Суспензия клеток каждой из двух групп (ФБС и ЛТ), была разделены на 3 подгруппы. Первая подгруппа клеток инкубировалась с 200 мкл активной человеческой сыворотки в течение 1 часа (пулированная сыворотка от добровольных доноров, AB(IV)Rh+). Вторую группу клеток инкубировали в течение 1 часа с сывороткой, предварительно обработанной анти-С5 моноклональными антителами (Soliris® (Eculizumab) Alexion Pharmaceuticals Inc.) в дозе 50 мкг/мл. Последнюю группу клеток (представленную в качестве контрольной группы) инкубировали в течение 1 часа с сывороткой, предварительно инактивированной ЭДТА. Анализ цитотоксичности проводился путём проточной цитометрии (в качестве индикатора жизнеспособности клеток был использован краситель 7-ААD).
Результаты. Около 30% полученных МСК были лизированы после 1 часа контакта с активной сывороткой. Этот эффект был ингибирован ЭДТА или специфическим ингибитором C5 – Экулизумабом, что доказывает наличие комплемент-зависимого лизиса клеток. В группе ФБС средняя цитотоксичность 1-й подгруппы достигла 27,9%, 2-й подгруппы – 15,4%, и 3-й подгруппы – 10,7% (р=0,00015). Мы не смогли показать статистически значимые различия в 3 группах клеток, культивированных в среде, содержащей 7,5% лизата человеческих тромбоцитов (ЛТ). Средняя цитотоксичность в 1-й подгруппе была 13,1%, 2-й – 15,5, 3-й – 7,5% (р=0,32).
Выводы
Полученные результаты подтверждают наличие феномена массивного комплемент-зависимого лизиса культивированных МСК после контакта с цельной сывороткой крови. МСК с добавлением лизата тромбоцитов в процессе культивирования показывают значимо меньшую восприимчивость или полное её отсутствие к комплимент-зависимому лизису. Одним из возможных объяснений этого наблюдения может быть отсутствие ксеноантигенов в средах, содержащих ЛТ. Инкубирование активной сыворотки с анти-С5 моноклональными антителами (Экулизумаб) значимо снижает лизис МСК, культивированных с добавлением ФБС, что демонструет возможный потенциал использования Экулизумаба в области клеточной терапии и трансплантации.
Ключевые слова
трансплантация, лизис клеток, комплемент-опосредованный, мезенхимные стволовые клетки
